T細(xì)胞免疫是適應(yīng)性免疫的重要組成部分， 在對(duì)抗病原微生物感染及抗腫瘤中均發(fā)揮核心作用。 T細(xì)胞免疫的關(guān)鍵步驟是TCR與相應(yīng)的pMHC的相互作用， MHC-I類分子通過(guò)遞呈表位多肽供細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞識(shí)別而引發(fā)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。 研究表位多肽與MHC分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)有助于深入理解T細(xì)胞免疫發(fā)生的細(xì)節(jié)和加快T細(xì)胞表位疫苗的開(kāi)發(fā)。人類的MHC分子也被稱作HLA分子， 經(jīng)典HLA I類分子是由重鏈和輕鏈經(jīng)非共價(jià)鍵連接成的異二聚體， 重鏈分別由HLA-A、HLA-B、HLA-C基因編碼， 因此經(jīng)典HLA-I類分子包括HLA-A, HLA-B和HLA-C三類。 目前鑒定的HLA基因型超過(guò)1000種， 相同多肽在不同型別HLA中交叉遞呈的現(xiàn)象很普遍， 于是便產(chǎn)生了基于多肽結(jié)合特點(diǎn)的新的HLA分型方法，這種分類方法將具有相同或相近多肽遞呈特征的HLA歸為一類， 稱為超級(jí)型（supertype）。 A2與A3兩個(gè)超級(jí)型是頻率較高的超級(jí)型， 在亞洲人群中的表型覆蓋率分別為44.7% 和47.9%。 HLA-A*6801和HLA-A*6802都是較為常見(jiàn)的HLA基因型，它們屬于相同的血清型， 但是鑒于它們截然不同的多肽結(jié)合特征，HLA-A*6801被歸入A3超級(jí)型， 而HLA-A*6802屬于A2超級(jí)型。 本研究解析了HLA-A*6801 和HLA-A*6802分別呈遞典型的A3和A2超級(jí)型限制多肽的晶體結(jié)構(gòu)， 且其中一個(gè)多肽與HLA-A*0201的復(fù)合物結(jié)構(gòu)之前已被解析， 通過(guò)復(fù)性和分子篩純化實(shí)驗(yàn)對(duì)多肽與HLA-A*6801 ，HLA-A*6802和 HLA-A*0201的結(jié)合能力進(jìn)行了分析。 研究的數(shù)據(jù)表明，HLA-A*6802和 HLA-A*0201的F口袋由相似的殘基構(gòu)成， 這個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)造成了它們呈遞多肽的相似特征， 而被共同劃入A2超級(jí)型。 然而， 與HLA-A*0201相比，HLA-A*6802所呈遞的多肽的構(gòu)象與HLA-A*6801更相似。 而且， 由于HLA-A*6802具有較淺的D口袋和一個(gè)較大的C口袋， 導(dǎo)致了一個(gè)自身肽與HLA-A*6802結(jié)合時(shí)其P3錨定殘基的構(gòu)象具有特殊性。 我們的發(fā)現(xiàn)有助于理解MHC微多態(tài)性導(dǎo)致的多肽呈遞特性分化的機(jī)理和A2及A3超級(jí)型分類的分子基礎(chǔ)。HLA-B*4001是亞洲人群中頻率最高的HLA-B類分子，HLA-B*4001與抗原肽的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究通過(guò)體外復(fù)性制備了HLA-B*4001與SARS病毒來(lái)源的表位（NP, residues216-225, GETALALLLL）的復(fù)合物的蛋白， 篩選得到了復(fù)合物的晶體， 分辨率達(dá)到2.3 ?， 經(jīng)分子置換法解析了其結(jié)構(gòu)。 通過(guò)對(duì)我們解出的晶體結(jié)構(gòu)及表位庫(kù)中的自然呈遞表位的序列進(jìn)行的分析， 我們對(duì)HLA-B*4001多肽結(jié)合基序有了更深刻的認(rèn)識(shí)。HLA-B*4001的表位庫(kù)顯示， 所有表位多肽的第二位非常保守， 均為Glu, C末端殘基局限于L、Y、F, 而在其他位置的氨基酸則可為任意氨基酸。 我們的HLA-B*4001-SARS的晶體結(jié)構(gòu)顯示， 表位多肽的第二位E作為錨定殘基插入抗原結(jié)合槽的B口袋， 第二位的E不僅和重鏈的His9和Arg62分別形成鹽鍵， 還和Lys45， Glu63 ，Tyr99形成三對(duì)氫鍵。 P1作為輔助錨定殘基完全包埋入PocketA中，PocketA入口處的Arg62和Glu163形成鹽橋， 對(duì)于穩(wěn)固多肽的N端錨定起到重要作用。 C末端錨定殘基L作為長(zhǎng)側(cè)鏈氨基酸在F口袋內(nèi)與重鏈的Ser77，Asn80，Tyr84，Ser143之間形成四對(duì)氫鍵， 還與眾多其它氨基酸之間存在范德華力相互作用。 MHC I類分子呈遞的抗原肽可以發(fā)生修飾， 例如磷酸化， 糖基化， 甲?；阴；?半胱氨酸化等。 半胱氨酸化是指抗原肽中存在半胱氨酸， 該半胱氨酸通過(guò)二硫鍵與另一個(gè)半胱氨酸結(jié)合。 研究表明同一條多肽在半胱氨酸化前后可以分別作為抗原激發(fā)不同的T細(xì)胞免疫。 HLA-A*0201限制性的H-Y和H-2Kd限制性的NP是兩條研究的較為深入的存在半胱氨酸化的抗原肽。 本研究解析了HLA-A*0201/H-Y和H-2Kd/NP的結(jié)構(gòu)。 分析多肽中的半胱氨酸的構(gòu)象發(fā)現(xiàn)， 半胱氨酸化修飾至少存在兩種方式， 一種方式是半胱氨酸化的過(guò)程中多肽本身存在的半胱氨酸的構(gòu)象不改變， 另一種則需要原多肽中的半胱氨酸構(gòu)象作出調(diào)整來(lái)連接另一個(gè)半胱氨酸。 半胱氨酸殘基位于表位多肽中被TCR識(shí)別的重要位置， 修飾后必然激活不同的T細(xì)胞反應(yīng)。 HLA-C類分子的表達(dá)和分布都明顯不同于HLA-A類分子和HLA-B類分子，HLA-C類分子在免疫抑制中發(fā)揮重要作用。 本研究發(fā)現(xiàn)， HLA-Cw*0102可以通過(guò)體外復(fù)性形成同源二聚體， 且該二聚體的形成不需要多肽和輕鏈的幫助。通過(guò)分子篩和離子交換等方法的純化， 我們得到了高純度的HLA-Cw*0102重鏈二聚體， 可用于后續(xù)的功能試驗(yàn)。 我們將HLA-Cw*0102全長(zhǎng)基因克隆入真核表達(dá)載體， 使HLA-Cw*0102與Flag標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)， 通過(guò)Western證明HLA-Cw*0102同源二聚體在真核細(xì)胞中存在。 令人感興趣的是，HLA-Cw*0102重鏈二聚體是通過(guò)二硫鍵形成的， 但形成二硫鍵的半胱氨酸并非來(lái)自“free cystein”, 而是來(lái)自經(jīng)典MHC結(jié)構(gòu)中形成分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸， 這必然破壞HLA分子的經(jīng)典構(gòu)象。 作為一種新的存在形式，HLA-C重鏈二聚體可能具有重要的病理生理意義。 制備高親和力的單克隆TCR對(duì)于病毒性疾病及腫瘤的診斷和治療都是非常有用的。 本研究嘗試將針對(duì)HLA-A*2402-Nef的TCRS19-2進(jìn)行改造并構(gòu)建入噬菌體表達(dá)載體pLITMUS 28中。 通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)表明， 我們構(gòu)建的重組噬菌體pLITMUS 28- S19-2表面表達(dá)了具備功能的TCR蛋白， 從而為進(jìn)一步構(gòu)建噬菌體庫(kù)， 篩選高親和力的TCR打下基礎(chǔ)。
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